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细胞的复苏

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细胞的复苏
细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至 37℃,使细胞外冻存时的 冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。 一. 实验前准备: 1.将水浴锅预热至 37℃ 2.用 75%酒精擦拭紫外线照射 30min 的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 二.取出冻存管: 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。 三.迅速解冻: 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。 2.约 1-2min 后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。 四.平衡离心:用架盘天平平衡后,放入离心机中 3000r/min 离心 3min 五.制备细胞悬液: 1.吸弃上清液。 2.向离心管内加入 10ml 培养液,吹打制成细胞悬液。 六.细胞计数: 细胞浓度以 5×105/ml 为宜。 七.培养细胞:

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入 37℃5%CO2 的培养箱内 2-4 小时(或 者 24-48 小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误: 初学者易犯错误: 1 水浴锅未预热或者未预热到 37℃。 2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。 3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。 4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。

版本 2 一、细胞复苏的原则 在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般 采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗 入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。 二、细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入 38℃水浴中,并不时摇动,在 1 分钟内使其完全融 化,然后在无菌下取出细胞。 (3)在 1000r/min 速度下离心 5~10 分钟,弃去上层液,加入适量 9 培养液后接种于培养瓶中,接种浓度 1×10 /L,置 37℃温箱静置培养, 次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及 时传代。 或无需离心直接将细胞加入瓶中, 并加入培养基贴壁培养 12~ 24 小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。 三、注意事项 在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安 瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏 的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其 他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在 培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获 得较为满意的结果。

博凌科为解答: 【材料】1.常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。2.培养液(DMEM)胎 牛血清(CBS)二甲基亚砜(DMSO) 【操作程序】1.细胞实验室进行常规消毒,紫外照射 40min 以上。2.培养液(DMEM) 、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱370C 预热20min, 备用。3.二甲基亚砜(DMSO)在40C 冰箱中冷藏30min,备用。4.从液氮保存罐中取出冻存 管,立即放入400C 水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。5.将细胞悬液移入15ml 离心 管,缓慢加入4ml 培养液,离心(1000r/min,5min) 。6.用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整 细胞浓度,方培养箱中培养。7.记录复苏日期。 【注意事项】1.取细胞的过程中注意带好防 冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上 升,可导致爆炸。2.冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚 砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大, 因此,必须在1-2min 内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲 基亚砜(DMSO)最好选择进口产品。3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜 浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。4.离心问题:目前主 要有两种见解。 一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养, 第二天 换液。因为离心的目的是两个,去除 DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人 来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活

细胞会受压过大, 死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬 液中含有二甲基亚砜 (DMSO) DMSO 对细胞有一定的毒副作用, , 所以须将离心后的液 体 前倒净,且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。 5.细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml 细胞液要加10ml-15m 培养液, 而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6.复苏细胞分装的问题:试验中 我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利 7.加培养基的量放入问题: 于细胞的贴壁。 这个量的多少的把握主要涉及到的问题是 DMSO 的浓度,从如果你加培养基的太少,那么 DMSO 的浓度就会比较大,就会影响 细胞生长, 从以前的资料来看,DMSO 的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个 说法是1%。 所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO 的话那么加10ml 以上的培养基就恰 好稀释到了无害浓度。


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